基因治療是通過將修飾的基因傳遞至靶細胞中，從而把患者體內(nèi)的突變基因替換為相對應(yīng)的健康基因拷貝來實現(xiàn)治療或者預(yù)防疾病的目的。與傳統(tǒng)的藥物治療相比，基因治療是從根本上對疾病進行控制，所以有著非常好的發(fā)展前景，在世界范圍內(nèi)得到越來越多醫(yī)藥行業(yè)的關(guān)注和投入。

將正常基因（外源）導(dǎo)入生物細胞內(nèi)必須借助一定的技術(shù)方法或載體，基因轉(zhuǎn)移的方法分為生物學(xué)方法、物理方法和化學(xué)方法。

病毒越來越多的用作載體，用于傳遞基因治療的遺傳物質(zhì)和疫苗應(yīng)用。重組腺相關(guān)病毒（recombinant Adeno-Associated Viruses, rAAV）是基因治療最為常用的病毒載體之一。

一、如何開發(fā)高效安全的 rAAV 療法?

為了開發(fā)通過受控和經(jīng)濟的制造工藝生產(chǎn)的高效的 rAAV 療法，需要解決從病毒衣殼設(shè)計到確定最佳工藝和配方條件，再到全面質(zhì)量控制的多重挑戰(zhàn)。應(yīng)對這些挑戰(zhàn)，需要針對 rAAV 樣品下列屬性進行量身定制的分析表征：

?  測定衣殼蛋白或者顆粒滴度（capsidor particle titer）

?  完整 rAAV 顆粒的百分比

?  空-載比（Full-empty ratio）

?  顆粒的粒徑

?  聚集體形成（aggregate formation）

?  熱穩(wěn)定性（Thermal stability）

?  基因組釋放（genome release）

?  衣殼電荷（capsid charge）等

而所有這些都可能影響最終產(chǎn)品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA）。

通常，rAAV 滴度和病毒載量是使用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）、液滴數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ddPCR）、分析超速離心（AUC）和電子顯微鏡（EM）的技術(shù)組合測定的。這些方法通常既費時又費力，而且其準(zhǔn)確性和精確性也值得懷疑[1]。因此，業(yè)內(nèi)越來越需求一種不依賴于使用專用試劑和昂貴的參考標(biāo)準(zhǔn)品的快速分析解決方案。

動態(tài)光散射(DLS)、多角度動態(tài)光散射（MADLS）、電泳光散射（ELS）、尺寸排阻色譜-多角度光散射（SEC-MALS）、納米顆粒跟蹤技術(shù)（NTA）、等溫滴定量熱法（ITC）和差式掃描量熱法（DSC）可以提供有關(guān)病毒載體的關(guān)鍵分析和質(zhì)量屬性的重要信息，從而能夠?qū)Χ喾N參數(shù)進行表征、比較和優(yōu)化。

表1 總結(jié)了病毒載體研究中各種重要的關(guān)鍵屬性（CQA），以及馬爾文帕納科可以對應(yīng)提供表征此類信息的各項技術(shù)。

DLS、MADLS、SEC-MALS、NTA、ITC和DSC屬于無標(biāo)記的生物物理技術(shù)，需要最少程度的方法開發(fā)，并且可以很容易的應(yīng)用于各個階段，強化了基因治療開發(fā)的分析工作流程。

二、高效的表征技術(shù)概念解讀

動態(tài)光散射（DLS）

動態(tài)光散射(DLS)是一種非侵入式技術(shù)，可以測量由顆粒分散體系或分子溶液引起的散射光強度隨時間的波動。由于進行布朗運動的顆粒或者分子的隨機運動，散射光的強度會隨之發(fā)生波動。使用自相關(guān)算法分析這些強度波動可以確定平移擴散系數(shù)，隨后根據(jù)斯托克斯-愛因斯坦方程確定流體力學(xué)尺寸。

多角度動態(tài)光散射（MADLS）

多角度動態(tài)光散射（MADLS）通過使用三個不同的檢測角度（背面、側(cè)面和正面）并將獲取的光散射信息組合成一個與角度無關(guān)（Angular-Independent）的粒徑分布，從而可以對多模態(tài)的樣品進行更高分辨率的尺寸測定。應(yīng)用MADLS技術(shù)的擴展還可以測量出顆粒濃度（Concentration）。

電泳光散射（ELS）

電泳光散射（ELS）測定來自在電場中進行電泳的顆粒或者分子的散射光的頻移（Frequency Shift），并能夠計算出Zeta電位。顆粒的Zeta電位是顆粒在特定介質(zhì)中獲得的總電荷，可用于預(yù)測分散體系的穩(wěn)定性并深入了解所研究的顆粒的表面化學(xué)。

尺寸排阻色譜（SEC）

尺寸排阻色譜（SEC）是一種分離技術(shù)，可根據(jù)分子進出柱中多孔凝膠基質(zhì)的流體力學(xué)半徑來分離分子。搭配一系列先進的檢測器，如光散射（LS）、UV、RI和粘度，可以測量絕對分子量、分子大小、特征粘度、支化和其他參數(shù)。

差式掃描量熱法（DSC）

差式掃描量熱法（DSC）是一種直接分析天然蛋白質(zhì)或其他生物分子熱穩(wěn)定性的技術(shù)，無需外在熒光素或者內(nèi)源熒光，它通過測定在恒定的升溫速率下使生物分子發(fā)生熱變性過程中的熱容變化來實現(xiàn)。

案例研究 | 綜合使用多種技術(shù)表征 rAAV性狀：衣殼分子量、聚集狀態(tài)、滴度、穩(wěn)定性……

1，空 rAAV5 衣殼分析

SEC-MALS (OMNI-SEC)測量產(chǎn)生的關(guān)鍵數(shù)據(jù)是絕對分子量，與柱保留時間或用于校準(zhǔn)系統(tǒng)的任何標(biāo)準(zhǔn)無關(guān)。在空rAAV的情況下（Fig.1 和表2），主要單體的Mw為3.84 x 10⁶ g/mol。空衣殼蛋白的理論分子量為3.8 x 10⁶ g/mol，證實該分析結(jié)果符合預(yù)期。

圖1 rAAV5 空殼三重色譜圖

表2 rAAV5空殼的定量參數(shù)

Mw/Mn 描述樣品的分散性，接近1的值表示峰中有單個群體，遠高于1的值表示峰內(nèi)有多個群體。在空 rAAV 的情況下，單體和二聚體的 Mw/Mn 值接近1，表明是單一群體。聚集體和碎片 Mw/Mn 值顯著高于1，表明單個峰內(nèi)具有不同分子量的多個群體（表2）。

樣品的分數(shù)（Fraction of Sample）描述了樣本在群體之間的分布情況，在這種情況下，84.7% 的樣品是單體。蛋白質(zhì)分數(shù)（Fraction of Protein）表示樣品中衣殼的百分比；在這種情況下，單體是99.8%的衣殼。這證實樣品是空的 rAAV5 。從這種單一分析方法中獲得的另一個關(guān)鍵信息是樣品滴度；在這種情況下，對于空的 rAAV5，測得的滴度為 5.91x10¹³ vp/mL。

2，完整 rAAV5 衣殼分析

完整 rAAV5衣殼的SEC-MALS (OMNISEC) 分析如圖2和表3所示。對于主要的單體峰，計算出的符合Mw為4.49 x 10⁶ g/mol，其中86%為衣殼。這樣，完整的rAAV5的蛋白質(zhì)組分的Mw為3.86 x 10⁶ g/mol，與表2中的空rAAV5衣殼生成的數(shù)據(jù)一致。單體部分占比93%，樣品具有總滴度7.48 x 10¹³ vp/mL。

圖2 完整 rAAV5 的三重色譜圖

表3 完整 rAAV5 的定量參數(shù)

3，rAAV5 穩(wěn)定性研究

病毒衣殼的穩(wěn)定性和功能是一種平衡行為。病毒衣殼必須足夠穩(wěn)定以包含和保護其中的基因組，與宿主細胞表面結(jié)合，它們必須提供足夠的構(gòu)象穩(wěn)定性以在復(fù)制位點釋放基因貨物。

AAV載體脫殼的機制仍然知之甚少。衣殼脫殼和基因組釋放似乎需要結(jié)構(gòu)變化。基于差示掃描熒光法和差示掃描量熱法（DSC）收集的AAV熱穩(wěn)定性已發(fā)表數(shù)據(jù)，AAV熱轉(zhuǎn)變的Tm值與衣殼解聚過程有關(guān)，可作為AAV血清型的鑒定指標(biāo)；一種血清型的空AAV衣殼和完整AAV衣殼的Tm值通常非常相似，并且它們與衣殼動力學(xué)、衣殼脫殼和基因組釋放沒有明顯的相關(guān)性。

圖3 空rAAV5 和完整 rAAV5的DSC數(shù)據(jù)比較，扣除空白和基線的DSC數(shù)據(jù)。垂直方向標(biāo)記的區(qū)域具有明顯不同的熱轉(zhuǎn)變過程。

表4 從DSC獲得的空 rAAV5 和完整 rAAV5 樣品的熱穩(wěn)定性結(jié)果

文章中記錄的完整和空 rAAV5 樣品的DSC曲線疊加（圖3），根據(jù)空 rAAV5 和完整rAAV5 樣品的整體 DSC 圖譜差異以及熱穩(wěn)定性參數(shù)（如 Tonset 和 Tm2，表 4），可以在圖 3 中 DSC 曲線上識別出四個不同的區(qū)域，它們可以暫且歸因于以下幾點：

#1■  僅在完整的 rAAV5 中出現(xiàn)的區(qū)域，從50℃一直延展至 75℃，這個過程大約 30 分鐘。這可能歸因于熱應(yīng)激下衣殼蛋白結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性變化導(dǎo)致的 ssDNA 的動力學(xué)控制下的注射；

#2■在空 rAAV5 中出現(xiàn)的明顯的預(yù)轉(zhuǎn)變過程；

#3■  主要轉(zhuǎn)變過程，即協(xié)同的 rAAV5 衣殼蛋白發(fā)生解組裝，這由具有血清型特異性的 Tm 值所決定；

#4■  僅在完整 rAAV5 中出現(xiàn)的另外的轉(zhuǎn)變過程，很可能歸因于 ssDNA 的解鏈。

結(jié)論：以上幾例是綜合應(yīng)用馬爾文帕納科多種互補技術(shù)對基因治療常用的AAV載體一些關(guān)鍵屬性的表征，這些無標(biāo)記生物物理技術(shù)需要最少的方法開發(fā)，可以從衣殼設(shè)計階段到開發(fā)、配方開發(fā)和藥物原料和產(chǎn)品進行深入表征，加強體內(nèi)基因治療開發(fā)的分析工作流程。

詳細內(nèi)容可參文獻 (Pharmaceutics 2021, 13(4), 586; doi.org/10.3390/pharmaceutics13040586）

[1] Burnham, B.; Nass, S.; Kong, E.; Mattingly, M.; Woodcock, D.; Song, A.; Wadsworth, S.; Cheng, S.H.; Scaria, A.; O’Riordan, C.R. Analytical ultracentrifugation as an approach to characterize recombinant adeno-associated viral vectors. Hum. Gene Ther. Methods 2015, 26, 228–242

三、納米粒度及電位分析儀：DLS/ ELS/ MADLS
馬爾文帕納科 Zetasizer Ultra 納米粒度及Zeta電位分析儀具有真正的多角度動態(tài)光散射技術(shù)（MADLS®），提供更高的粒度測量分辨率，及與角度無關(guān)的粒度結(jié)果，并能夠測量顆粒濃度。

圖4 Zetasizer Ultra納米粒度及Zeta電位分析儀

四、OMNISEC 凝膠滲透色譜儀：GPC/SEC

馬爾文帕納科OMNISEC凝膠滲透色譜儀是一套完整的凝膠滲透/尺寸排阻色譜(GPC)/(SEC)，有前端色譜分離系統(tǒng)、檢測器和軟件組成，是靈敏準(zhǔn)確的多檢測器GPC/SEC 系統(tǒng)，可以準(zhǔn)確測定：

?  絕對分子量和分子量分布

?  特性粘度和分子結(jié)構(gòu)

?  樣品濃度

?  以及其他多種關(guān)鍵參數(shù)

圖5 OMNISEC凝膠滲透色譜儀

五、PEAQ-DSC 微量熱差示掃描量熱儀：DSC
馬爾文帕納科 MICROCLA PEAQ-DSC 微量熱差示掃描量熱儀能夠幫助用戶快速確認維持高級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的最佳條件，提供簡潔、無縫的工作流程和自動化批量數(shù)據(jù)分析，其所提供的熱穩(wěn)定性信息被業(yè)內(nèi)視為“金標(biāo)準(zhǔn)"技術(shù)，是一種非標(biāo)記、全局性的數(shù)據(jù)。

圖6 MicroCal PEAQ-DSC 微量熱差示掃描量熱儀

關(guān)于馬爾文帕納科

馬爾文帕納科的使命是通過對材料進行化學(xué)、物性和結(jié)構(gòu)分析，打造出客戶導(dǎo)向型創(chuàng)新解決方案和服務(wù)，從而提高效率和產(chǎn)生可觀的經(jīng)濟效益。通過利用包括人工智能在內(nèi)的技術(shù)發(fā)展，我們能夠逐步實現(xiàn)這一目標(biāo)。這將讓各個行業(yè)和組織的科學(xué)家和工程師可解決一系列難題，如提高生產(chǎn)率、開發(fā)更高質(zhì)量的產(chǎn)品，并縮短產(chǎn)品上市時間。